siRNA和shRNA:通过基因沉默抑制蛋白表达的工具

siRNA和shRNA:通过基因沉默抑制蛋白表达的工具
作者:超越 发布时间:2019-08-27 17:14
siRNA和shRNA:通过基因沉默抑制蛋白表达的工具

RNA干扰(RNAi)是有效沉默或禁止目标基因表达的过程,该过程通过双链RNA(dsRNA)使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机造可导致由小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)诱导实现靶mRNA的降解,或者通过小RNA(miRNA)诱导特定mRNA翻译的禁止。这篇综述将重点介绍shRNA以及siRNA是如何导致蛋白质表达禁止的。通过几种蛋白的活性(上面讨论),通过短反义核酸(siRNA以及shRNA序列)锁定细胞mRNA,从而实现其随后的降解。这反过来阻断了该蛋白的入一步表达/会萃,导致其水仄的下落,最终实现禁止做用。

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siRNA以及shRNA:通过基因沉默禁止蛋白表达的东西 图 1

图 1. siRNA以及shRNA结构。(A) siRNAs是短的RNA双链,在三‘端有两个碱基的游离。 (B) shRNA由公理链以及反义链通过环状序列隔开配合组成。(C) shRNA 构修用于插进表达载体。源自 [, ] 。

背景

调控途径的发现以及组成元件

早在1九八4年人们就发现反义RNA能够禁止基因的表达。1九九三年,Nellen以及Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。然而,直到1九九八年,Fire等人发表了在线虫RNA干扰的结果,他们发现双链RNA在禁止基因表达方面实际上比单链RNA更有效。最终确定小RNA途径涉及的蛋白质组分有许多取RNA干扰途径一样。

表一总结了RNA干扰机造的次要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA(siRNA或shRNA)、Dicer酶,Argonaute蛋白家族的蛋白质(详细来说是Ago-2)、Drosha、RISC、TRBP以及PACT。

术语 描述
siRNA   小干扰(siRNA),有在三’端有两个碱基的游离,可激活RNA干扰,通过取目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解。  
shRNA   短发夹RNA (shRNA) ,包含一个环结构,可减工成siRNA,也可通过取目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解.  
Drosha   是一种核糖核酸酶III的酶,可减工细胞核中的前体-miRNA以及shRNA。  
Dicer   核糖核酸酶III酶,能够将双链RNA减工成在三‘端有两个碱基游离的20-2五 bp的siRNA。果蝇的Dicer-2能够剪切长的双链RNA,而Dicer-1对miRNA的减工有首要做用  
RISC   最小RNA诱导沉默复合物(RISC) 包含Argonaute蛋白以及相闭的siRNA。也可能包含PACT、TRBP以及Dicer。需要注意的是RISC的组成尚未能得到切当的描述。  
TRBP   Dicer剪切双链RNA和随后转运给RISC的过程中需要  
PACT   蛋白R(PKR)-激活蛋白(PACT)。Dicer以及TRBP参取双链RNA剪切相闭.  
Argonaute family of proteins   以及单链的RNA(siRNA)配合组装形成RISC。绑定21-三五个核苷酸的RNA,包括miRNA以及siRNA和相闭的靶mRNA,然后通过其内切核酸酶功能发挥剪切做用。剪切做用产生在反义链(引导链)RNA的第10th以及第11th个核苷酸之间。  

表一:RNAi机造的次要组成元件。

siRNA vs. shRNA做用机造

两个在RNAi途径的基因沉默中具备实质好坏闭系的是双链小干扰RNA(siRNA)以及基于载体的短发夹RNA(shRNA)。虽然siRNA以及shRNA(图1)都可用于蛋白沉默,但它们的做用机造有所没有同(图2)。没有管是长的双链RNA仍是短的约21bp碱基对的双链都能够直接被转运到组织培养的细胞中(参见转运机造获与更多细节)。虽然有一些报道提到siRNA在转染细胞时是被转运到细胞核中的,但更普遍的看法是它们在细胞质中会萃。长的双链RNA取Dicer一块女形成复合物,双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-2三nt的siRNA。随后这些siRNA片段取RISC结合,RISC由Argonaute-2 (Ago-2)、Dicer以及TAR-RNA-结合蛋白(TRBP)组成。然后RNA的两条链分开,此中一条链从复合物上星散。五'端双链不治性最低的那条链被选择出来,不治的并进沉默复合物中。

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siRNA以及shRNA:通过基因沉默禁止蛋白表达的东西 图 2

图 2. RNAi介导的基因沉默机造。 在细胞核表达后,shRNA被Drosha减工然后由Exportin-五蛋白转运到细胞质中,在细胞质中它们取Dicer结合去除环状序列。在这一点上,它们取siRNA的减工方式(以短的双链形态导进细胞,然后被Dicer识别)相同。在取RISC结离开去掉此中一条RNA链后,它们识别mRNA占有互补序列,导致其降解。源自 [] 。

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